in situ Hybridization – SIEVEWELL™

SIEVEWELLを用いたシングルセルのin situ Hybridization

1. in situ Hybridization（ISH）の概要

in situ hybridization（ISH）は、細胞や組織の形態構造を保持したまま、特定のDNAまたはRNA配列を検出・可視化する分子生物学的手法である。この技術の基本原理は非常にシンプルで、相補的な核酸配列同士が特異的に結合する性質（ハイブリダイゼーション）を利用する点にある。

ISHの基本フロー

試料固定（細胞・組織の構造保持）
透過化（プローブ侵入）
プローブのハイブリダイゼーション
非特異的結合の除去（洗浄）
シグナル検出（蛍光または発色）

2. ISHの技術的発展と課題

従来のISH（特にFISH/CISH）は強力な手法である一方、以下の課題が存在する。

課題

感度不足（低コピーmRNA検出が困難）
バックグラウンドシグナル
多段階プロトコル（酵素反応やProK処理）
時間・手間が大きい

これらを解決するために近年発展したのが、シグナル増幅技術（HCR, SABERなど）である。

RNA scope（branched DNA系）

標的RNAに隣接して結合する2本のプローブをトリガーとして、多段階のbranched DNA構造を形成し蛍光プローブを多数結合させる手法。高感度・高特異性で臨床・組織解析に広く使われる。

PLISH（Proximity Ligation ISH）

2本のプローブが同一RNA上で近接したときのみDNAライゲーションが起こり、環状DNAを形成しRolling Circle Amplification（RCA）で増幅する。近接依存により非常に高い特異性を持ち、シングル分子検出が可能だが、酵素反応への依存性がある。

SABER（Signal Amplification by Exchange Reaction）

標的プローブにあらかじめ設計したDNA concatemer（繰り返し配列）を結合させ、多数の蛍光プローブを付加することでシグナルを増幅する。酵素不要で再現性が高く、多重化に強いが、事前設計が必要。

in situ Hybridization Chain Reaction

ヘアピンDNAの自己組織化連鎖反応により、酵素を用いずに蛍光DNAを重合させて増幅する手法。

**4. SIEVEWELLを用いたin situ Hybridization Chain Reaction**

ISHpalette™を使用したB8/3（マウス赤白血病細胞株）のGAPDHを検出した例を示す。ISHpalette™は、東邦大学の恒岡洋右准教授が開発した技術をベースにネッパジーン社が製品化しており、標的配列に対する短いオリゴDNAをデザインすることで高い特異性と感度を実現している。

細胞　B8/3 マウス赤白血病細胞株（JCRB0238、JCRB細胞バンクより購入した）

試薬

ヘアピンDNA　IPL-R-S41　ISHpalette™ Short hairpin amplifier, ATTO550-S41　ネッパジーン
ハイブリダイゼーションバッファー　IPL-HB　ISHpalette™ Hybridization buffer　ネッパジーン
アンプリフィケーションバッファー　IPL-AB　ISHpalette™ Amplification buffer　ネッパジーン
ターゲットプローブ mouse GAPDH

ターゲットプローブ配列

Probe1
Gapdh-17-P1S41 GCTCGACGTaaCCTGATGAACCTAAGCTGGGACCCC
Gapdh-120-P1S41 GCTCGACGTaaGCAAATGGCAGCCCTGGTGACCAGG
Gapdh-174-P1S41 GCTCGACGTaaGTAGTTGAGGTCAATGAAGGGGTCG
Gapdh-258-P1S41 GCTCGACGTaaGTTGATGACAAGCTTCCCATTCTCG
Gapdh-342-P1S41 GCTCGACGTaaAGACTCCACGACATACTCAGCACCG
Gapdh-456-P1S41 GCTCGACGTaaGTTCACACCCATCACAAACATGGGG
Gapdh-547-P1S41 GCTCGACGTaaTGTCATGGATGACCTTGGCCAGGGG
Gapdh-677-P1S41 GCTCGACGTaaGATGCAGGGATGATGTTCTGGGCAG
Gapdh-729-P1S41 GCTCGACGTaaCTTCCCGTTCAGCTCTGGGATGACC
Gapdh-814-P1S41 GCTCGACGTaaCATACTTGGCAGGTTTCTCCAGGCG

Probe2
Gapdh-17-P2S41 GGACGAGGAAACACTCTCCTGAGTTaaTCCTTTGCAACA
Gapdh-120-P2S41 GATGGCAACAATCTCCACTTTGCCAaaTCCTTTGCAACA
Gapdh-174-P2S41 GGAGTCATACTGGAACATGTAGACCaaTCCTTTGCAACA
Gapdh-258-P2S41 CTCCTGGAAGATGGTGATGGGCTTCaaTCCTTTGCAACA
Gapdh-342-P2S41 CTTCTCCATGGTGGTGAAGACACCAaaTCCTTTGCAACA
Gapdh-456-P2S41 CTTGAGTGAGTTGTCATATTTCTCGaaTCCTTTGCAACA
Gapdh-547-P2S41 TCATGAGCCCTTCCACAATGCCAAAaaTCCTTTGCAACA
Gapdh-677-P2S41 TTGCCCACAGCCTTGGCAGCACCAGaaTCCTTTGCAACA
Gapdh-729-P2S41 AGGAACACGGAAGGCCATGCCAGTGaaTCCTTTGCAACA
Gapdh-814-P2S41 CCTGCTTCACCACCTTCTTGATGTCaaTCCTTTGCAACA

プロトコール

Load cells into SIEVEWELL Hex20
4% PFA 10 min RT
Washing with PBST RT x3
100% EtOH 10 min RT
Washing with PBST RT x3
Pre-hybridization RT 5 min
Hybridization at 37 ℃ Overnight
Washing with 0.5× SSCT at 37 ℃x3
Pre-amplification with Amplification Buffer at 25 ℃ for ≥ 5 min
Amplification: Amplification Buffer containing Short hairpin amplifiers at 25 ℃, 2 hours
Washing with PBST at 37 ℃ x3
Washing with PBS at RT x1
Mounting